BMP7与心肌再生，2024年5月28日发表在Cell Rep上，已有公众号文章解读 BMP7促进斑马鱼和成年小鼠心肌细胞再生
首先作者直接聚焦在生长因子，看哪些生长因子和心肌细胞增殖有关。基本的逻辑就是先看发育过程中哪些生长因子的表达水平变化和心肌细胞增殖能力变化趋势一致，先确定相关性。作者用到的生长因子的库是一个商业可购买的生长因子panel，一共有117种生长因子。用到的数据是既往已发表文献的两个RNAseq测序数据：
1. Haubner, B.J., Adamowicz-Brice, M., Khadayate, S., Tiefenthaler, V., Metzler, B., Aitman, T., and Penninger, J.M. (2012). Complete cardiac regeneration in a mouse model of myocardial infarction. Aging (Albany. NY) 4, 966–977. https://doi.org/10.18632/aging.100526.
P1和P10小鼠心脏bulk RNA-seq，按降幅排序，取降低幅度大于50%且具有统计学意义的基因
2.Talman, V., Teppo, J., Po¨ ho¨ , P., Movahedi, P., Vaikkinen, A., Karhu, S.T., Tro st, K., Suvitaival, T., Heikkonen, J., Pahikkala, T., et al. (2018). Molecular Atlas of Postnatal Mouse Heart Development. J. Am. Heart Assoc. 7, e010378. https://doi.org/10.1161/JAHA.118.010378.
第二套数据进行验证，P1和P9小鼠心脏bulk RNA-seq，同样的筛基因的方法。
两套数据相互印证，并取了合集（为啥不是取交集？取交集是13个，取合集是23个）并且作者根据表达丰度进行了分类，分为高丰度和低丰度的（这一点值得学习，丰度也很关键，丰度太低或许没有多大意义且不利于后续研究的开展）。Among these, genes encoding BMP7, interleukin (IL)1RA, NRG1b, CTGF, GDNF, IL23a, BNP (NPPB), insulin growth factor (IGF)2, LGALS7 (GAL7), and LGALS3 (GAL3) were abundantly expressed at P1, while genes encoding for IGFBP1, FGF23, IL1b, IL17b, CXCL17, IL17f, CCL3, CXCL14, GDF5 (BMP14), IL6, soluble receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (sRANKL) (TNFSF1L), and IL10 had low expression levels at P1 (Figures 1A and 1B)
然后买23个生长因子的重组蛋白（有点贵，买量小的或许可以）进行细胞实验，看看促心肌细胞增殖的效果，确定因果关系。结果基本都能促进增殖，有个别没有统计学意义，然后根据促增殖的程度进行排序，选大于1.5倍的，一共有9个（去掉3个已发表的NRG1，IGF2，IL6，还剩6个：CXCL17, BMP7, LGALS7 (GAL7), GDF5 (BMP14), CCL3, and IL1RA）。
继续换了个指标进行检测——Ki67，BMP7促增殖效果最强；
再进一步增加增殖指标——AuroB，只有加BMP7组有显著差异。
siRNA敲低BMP7，结合BMP7重组蛋白实验证明BMP7是心肌细胞增殖的充分必要条件。（这个实验设计的很好，值得学习，设置了“敲低的同时加重组蛋白组”，此前的文章中未曾见过）
在斑马鱼中在体证明敲低或过表达bmp7可以分别抑制和促进心肌细胞增殖（心脏损伤模型中）
小鼠不同时间点心脏组织BMP7表达量检测（bulk、CM/non-CM）；P7原代CM培养（图片显示的心肌细胞竟然很圆，就有点离谱了），给BMP7刺激，设置了不同浓度组（10ng/ml，100ng/ml），能促进增殖。成年小鼠心梗模型，MI术后第二天开始连续注射10天BMP7（静脉或腹腔注射），检测border zone和remote zone的心肌细胞增殖情况。
以上这些筛选的部分值得学习，借鉴公开数据库；细胞实验和在体实验都很常规；接下来的机制实验也值得学习，要多看co-manipulation的实验设计
首先找BMP的受体，分为1型和2型受体，BMPs have been reported to signal through ACVRL1, ACVR1, BMPR1A, ACVR1B, and BMPR1B as type I receptors, and BMPR2, ACVR2A, and ACVR2B as type II receptors.通过文献检索来看BMP7能够结合的受体有哪些，BMP7 has been shown to bind and activate ACVR1, BMPR1A, BMPR2, ACVR2A, BMPR1B, and ACVR2B in different cell types and development stages.
此处再次用到了公开数据库（本文的第三个公开数据库，Quaife-Ryan, G.A., Sim, C.B., Ziemann, M., Kaspi, A., Rafehi, H., Ramialison, M., El-Osta, A., Hudson, J.E., and Porrello, E.R. (2017). Multi-Cellular Transcriptional Analysis of Mammalian Heart Regeneration. Circulation 136, 1123–1139. https://doi.org/10.1161/CIRCULATIONAHA.117.028252。学习之，善用公开数据库）来看乳鼠心肌细胞中上述6个能和BMP7结合的受体的表达情况，不表达的就不做后续实验研究了。然后用siRNA把受体都敲一遍，并结合给BMP7重组蛋白的细胞实验，看看哪个受体是下游受体。
co-manipulation值得学习的一个作图方式
也是继续读文献了解经典的BMP下游机制：BMP结合II型受体，磷酸化I型受体的激酶区域，然后激活下游多个通路。包括SMAD1，SMAD5，SMAD8/9，一旦磷酸化激活，单个或两个SMAD会和SMAD4结合形成异二聚体或异三聚体复合物并易位到核内。
cardiomyocyte-enriched culture 是什么啊？可能就是原代心肌细胞培养的另一种严谨的说法。作者还进行了cardiac cell culture，即所有心脏细胞一起培养，有点意思。
然后继续通过上述co-manipulation的方法看到底是哪一个SMAD在起作用。
同上 分组和展示方式值得学习
下游机制还是从文献里来"BMP激活下游非经典通路，包括ERK和AKT"（为什么非得是非经典途径呢）再用ERK和AKI通路抑制剂和BMP7重组蛋白来做co-manipulation实验，和上述思路一致。
小结：
1. 善用公开数据进行探索或佐证自己的观点
2. 筛选工作假设引入更简单，工作思路更简单，得到的结果更可信，可以用一部分筛选工作抵消一部分机制实验的深入探索部分。
3. co-manipulation的思路及数据呈现方式学习