结直肠癌（CRC）是世界上第三大最常见和最致命的癌种之一，CRC患者的5年生存率低于20%，且肿瘤转移而致死的患者占CRC死亡患者的90%。在CRC中，最常见的转移部位是淋巴结、肝脏和肺部，但也有一部分CRC可以转移到骨骼和卵巢。在过去的研究中，人们发现，尽管肿瘤中存在许多异质细胞，但存在某些特殊的恶性细胞群会驱动癌症的复发或远端转移。而目前，哪种特殊的恶性细胞群会参与CRC恶性肿瘤的远端转移仍不清楚。
2023年11月30日，中山大学郑健、林东昕及林俊忠等教授团队在 Gut 杂志上发表了一篇题为 Single-cell transcriptomic analysis deciphers heterogenous cancer stem-like cells in colorectal cancer and their organ-specific metastasis 的研究论文。在该研究中，作者对原发性结直肠癌（CRC）和肝脏转移灶（lCRC）或卵巢转移灶（oCRC）进行了单细胞转录组和空间转录组测序分析，鉴定到了一个具有PTPRO+ASCL2+特征的肿瘤干样细胞是导致CRC转移的驱动者。该细胞群由不同的异质性亚群组成，并显示出不同的肝脏或卵巢转移偏好性。此外，其中一亚群会通过DLL4-NOTCH信号通路与癌症相关成纤维细胞（CAF）和内皮细胞相互作用，从而促进原发性CRC向卵巢器官转移。综上，该研究揭示了CRC中驱动肿瘤发展和转移的异质肿瘤细胞，鉴定了CRC向卵巢转移过程中的关键细胞群体。
01 CRC、lCRC及oCRC的单细胞转录组全景
作者对7名有远端转移CRC患者的29份样本进行了scRNA-seq测序（8例原发性CRC、5例oCRC、2例lCRC、7例邻近正常组织和7例外周血单核细胞）。另外，并通过下载已公开的24例患者41个样本的scRNA数据（29例CRC和12例邻近正常组织）对数据进行了补充。经过质量控制和批次校正后，作者得到了230818个高质量的细胞数据，利用不同细胞群的经典标记物，作者确定了10种细胞类型，包括上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和胶质细胞等4种非免疫细胞类型和B细胞、T细胞、髓系细胞、肥大细胞、巨核细胞和浆B细胞等6种免疫细胞类型。
02 CRC肿瘤干细胞样细胞是癌症转移的驱动者
作者进一步对EPCAM+和KRT18+的上皮细胞进行了细分群，发现所有患者都存在14种不同的亚型。而且14种细胞亚型中包含了5种恶性细胞亚型，包括高表达ASCL2和PTPRO的干细胞样细胞、表达DNAJB1和RND3的DNAJB1+肿瘤细胞、表达FDPS和SCD的FDPS+恶性细胞、表达GPRC5A和SLC2A1的GPRC5A+恶性细胞以及表达IL32和S100A11的IL32+恶性细胞。其中正常的结直肠组织中富集了肠细胞，lCRC中富集了胆管细胞，而原发性和转移性CRC样本中都富集了干细胞样细胞和其他恶性细胞亚型。在CytoTRACE分析中，结果显示在lCRC或oCRC中，干样细胞的分化潜能明显高于其他细胞类型。PAGA分析中，干样细胞与恶性细胞亚型的进化关系更为密切。不仅如此，在所有上皮细胞亚型中，干样细胞的干性特征最高。以上结果表明，干样细胞可能是CRC转移的驱动者。
03 CRC转移中的CRC干样细胞的异质性导致的器官转移偏好性
作者进一步探究该特殊的干样细胞群是否具有异质性和这异质性是否会影响肿瘤的发展。通过分析，作者将干样细胞分为八个不同的亚群（P1至P8），所有亚群都表现出干细胞特性，而且其中一个亚群显示出高增殖能力。在统计分析中，作者发现，P1和P2在oCRC中富集，而P3和P4在lCRC中富集。在原发性CRC和oCRC中，P1细胞的比例分别为48.57%和45.85%，但在原发性CRC和lCRC中，P3细胞的比例分别为65.35%和24.64%。P1和P3细胞在oCRC和lCRC中的相对高比例分布暗示了这些干样细胞可能分别作为CRC向两个不同器官进行转移的驱动者。
作者在补充的空间转录组学测序（n=4）分析中还发现，P1和P3在空间分布模式与在单细胞数据的分析结果一致。P1和P2细胞具有独特的MAFA和DLL4高表达，而P3和P4细胞则具有TOMM6、CXCL14、ATP6V0C、PSMA6、CALML4、DBNDD2、RNASE4和DEFB1的高表达。转录因子分析表明，ELF3（在卵巢癌恶性表型中起主导作用的转录因子）在P1中有着明显的表达，而ETV4（肝癌发展相关的转录因子）也在P3中有着明显的表达。临床组织样本的免疫组织化学染色显示，转移至卵巢的原发性CRC的ELF3水平高于转移至肝脏的原发性CRC；而转移至肝脏的原发性CRC的ETV4水平又高于转移至卵巢的原发性CRC。因此，以上结果表明异质的肿瘤干样细胞亚群中差异的关键转录因子表达活性可能决定了原发性CRC向不同器官转移的偏好性。
04 CRC转移中干样细胞与CAFs和分化内皮细胞的相互作用
为了探索可能介导CAFs与肿瘤干样细胞相互作用并促进CRC转移的分子，作者对数据中的成纤维细胞进行了细分群和与肿瘤干样细胞的互作分析。互作分析中，作者发现在干样细胞与CAFs之间的配体-受体对中PDGFA-PDGFR A、DLL4-NOTCH2和DLL4-NOTCH3在P1细胞中明显富集，而且在TCGA-COAD队列中的高表达患者生存时间要更短。
在内皮细胞的细分群中，作者确定了10个亚群，其中Art_NOTCH4（DLL4的另一种受体）、Tip_COL4A1、Veins_ACKR1和Veins_SERPINE1亚型在原发性CRC中富集。TCGA-COAD队列患者的生存分析中表示，有转移的患者的Art_NOTCH4和Tip_COL4A1的得分明显高于没有转移的患者；相反，无转移患者的Veins_ACKR1和Veins_SERPINE1得分高于有转移的患者。Art_NOTCH4和Tip_COL4A1细胞有着相似的信号通路被激活（如NOTCH），而Veins_ACKR1和Veins_SERPINE1的NOTCH通路水平则降低。此外，Art_ NOTCH4和Tip_COL4A1表达的NOTCH关键组分（NOTCH1、NOTCH4、HEY1、JAG2 和RBPJ）水平明显更高。体外内皮细胞迁移实验结果表明，敲除ASCL2、PTPRO或DLL4的CRC细胞经内皮细胞迁移的能力明显下降。因此，以上结果表明，P1细胞可通过其过度表达的配体DLL4与原发性CRC微环境中的CAFs和内皮细胞上的NOTCH受体相互作用，从而促进它们向卵巢转移。
结论和意义
该研究通过综合单细胞测序、空间转录组学的测序分析，发现了一个以PTPRO和ASCL2为特征的肿瘤干样细胞群是CRC转移的驱动者，亚群进一步细分和鉴定后，发现不同的异质干样细胞亚群显示出不同的肝脏或卵巢器官转移偏好性。在原发性CRC中，转移的CRC细胞通过NOTCH信号通路与CAFs和内皮细胞相互作用，从而促进CRC向卵巢转移。该研究为CRC转移到卵巢和肝脏提供了新的理论基础，发现了驱动CRC向其他器官进行转移的关键异质肿瘤细胞亚型，为未来结直肠癌治疗和诊断提供了新方向。
参考文献：
Li R, Liu X, Huang X, Zhang D, Chen Z, Zhang J, Bai R, Zhang S, Zhao H, Xu Z, Zeng L, Zhuang L, Wen S, Wu S, Li M, Zuo Z, Lin J, Lin D, Zheng J. Single-cell transcriptomic analysis deciphers heterogenous cancer stem-like cells in colorectal cancer and their organ-specific metastasis. Gut. 2023 Nov 30:gutjnl-2023-330243. doi: 10.1136/gutjnl-2023-330243. Epub ahead of print. PMID: 38050068.
